Využití avidin-biotinové technologie pro elektrochemickou detekci nukleových kyselin
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2004 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | Sborník příspěvků VIII. pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Elektrochemie |
| Klíčová slova | Avidin-biotin technologa; nucleic acids; electrochemical detection of NA; carbon paste electrode; streptavidin |
| Popis | Bakterie Streptomyces avidinii produkuje streptavidin (STV), který váže biotin ze svého okolí. STV je tetramer o čtyřech identických podjednotkách složených z osmi antiparalelních beta-skládaných listů STV je složen ze 159 aminokyselin (obsahuje 6 molekul tyrosinů a 6 tryptofanů). Nedávno jsme publikovali modifikaci uhlíkové pastové elektrody STV. Elektrodový systém se skládal z modifikované pastové uhlíkové pracovní elektrody (uhlík:minerální olej; STV), Ag/AgCl/3M KCl (referenční elektroda) a pomocné platinové elektrody. Množství uhlíku a minerálního oleje ovlivňuje elektrochemickou odpověď STV přítomného v pracovní elektrodě. Zjistili jsme, že maximální signál 10 mg/mL STV přítomného v pracovní elektrodě získáme při poměru 70/30 (uhlík/minerální olej). Elektrochemické měření technikou adsorptivní přenosové square wave voltametrie (AdT SWV) bylo provedeno v prostředí acetátového pufru. Studovali jsme vliv různých koncentrací (5 -500 ng/mL) STV přidaných do pastové elektrody. Zaznamenané výšky oxidačních signálů STV vykazovaly lineární závislost vyjádřenou rovnicí: y = 1.0043x + 9.0444 (R2 = 0.996). Limit detekce STV přítomného v pracovní elektrodě byl pod 5 ng/mL. Změnou výšek elektrochemických signálů STV bylo možné pozorovat vazbu STV s biotinem. Biotin vázající se na STV vede k rychlému poklesu oxidačního signálu STV. Tohoto jevu jsme využili k analýze nukleových kyselin značených biotinem. Analyzovaný vzorek biotinylované nukleové kyseliny byl adsorbován z 6 mL a elektroda omyta v 80% ethanolu (odmytí nespecificky vázané DNA). AdT SWV poskytovala tři oxidační signály. Kolem potenciálu 0.6 V byl sledován signál STV přítomného v elektrodě, kolem potenciálu 0.8 V byl pozorovatelný oxidační signál guaninu a kolem 1.0 V se objevuje oxidační signál adeninu. Studované elektrochemické signály STV, guaninu a adeninu se mění v závislosti na jejich koncentraci. Se vzrůstající koncentraci biotinylem značené nukleové kyselin signál STV klesá a signály guaninu a adeninu vzrůstají. Nejnižší detekované koncentrace biotinylované nukleové kyseliny se pohybovaly kolem 5 mg/mL. |
| Související projekty: |